廣義的硬皮病包括由增厚、硬化的皮膚損傷所 引起的一系列異質(zhì)性疾病，根據(jù)是否存在系統(tǒng)受 累，可將其分為局灶性硬皮病和系統(tǒng)性硬皮病( systemic scleroderma，SSc) 。其中 SSc 病因復(fù)雜，以 皮膚、內(nèi)臟纖維化為主要特征，其致病機(jī)制主要?dú)w結(jié) 于自身免疫紊亂、血管損傷與成纖維細(xì)胞活化并過(guò) 度表達(dá)等方面。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指在各種因素影響 下，內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，獲得成纖維細(xì)胞特性 的轉(zhuǎn)化過(guò)程，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在纖維化、動(dòng)脈粥樣 硬化和腫瘤等疾病的發(fā)展中起著重要作用。內(nèi) 皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與 SSc 發(fā)病，是 SSc 纖維化過(guò)程的重 要始發(fā)因素。因此，通過(guò)研究尋找能延緩甚至逆 轉(zhuǎn)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生、發(fā)展的有效藥物，可能為防治 SSc 提供潛在治療藥物。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 ( transforming growth factor-β1，TGF-β1) 是誘導(dǎo)內(nèi)皮間質(zhì) 轉(zhuǎn)化發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。研究表明，在 SSc 的發(fā)病機(jī)制中，被 THBS、纖維蛋白溶酶等激活后， TGF-β1 可調(diào)控復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)反應(yīng)從而介導(dǎo) EnMT 過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞抗原。補(bǔ)腎益 精法是鄧鐵濤教授運(yùn)用“肺脾腎相關(guān)辨治硬皮病” 理論，結(jié)合嶺南獨(dú)特的地理環(huán)境所擬定的中醫(yī)特色 治法。本課題組前期研究顯示，補(bǔ)腎益精中藥復(fù) 方在體內(nèi)外具有抗 SSc 皮膚纖維化的效果，但復(fù) 方是否為通過(guò)抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制抗皮膚纖維 化尚不明確。因此，本研究將探討補(bǔ)腎益精中藥復(fù) 方對(duì) TGF-β1 誘導(dǎo)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型的作用及機(jī) 制，為臨床早期干預(yù) SSc 提供有力證據(jù)。

20 只雄性 SD 大鼠，6 ～ 8周齡，體質(zhì)量( 190 ± 5) g，SPF 級(jí)，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中 心，許 可 證 號(hào): SCXK ( 粵) 2016-0029。HUVEC 購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。HUVEC 培養(yǎng): 培養(yǎng)基為 DMEM-H，10% FBS，1% P /S，pH = 7． 0 ～ 7． 5，于 37 ℃、5% CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

黃芪甲苷購(gòu)于廣州市藥品檢驗(yàn) 所; 0． 25% Trypsin-EDTA( 1X) ( GIBCO 15090-046) 、 PBS pH 7． 4 basic ( 1X) ( GIBCO C10010500BT) 、 TGF-β1( PeproTech，96-AF-100-21C-10) 、Trizol( MＲC TＲ118-500) 、M-MLV Ｒeverse Transcriptase( Promega， M1705) 、GoTaq  qPCＲ Master Mix ( Promega， A6002) 。

電子天平( 上海精密科學(xué)儀器， JA1003N) ，基 因 擴(kuò) 增 儀 ( Hema，Hema9600 ) 、Ｒealtime Quantitative PCＲ( Bio-Ｒad，MiniOpticon) ，電泳 儀( TanonEPS 200) ，TS-2000A 脫色搖床( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司 TS-2000A ) ，正置光學(xué)顯 微鏡 ( 日 本 尼 康 NIKONECLIPSEE100 ) 、成像系統(tǒng)( 日本尼康 NIKONDS-U3) 。

HUVEC 細(xì)胞建立內(nèi)皮間質(zhì) 轉(zhuǎn)化模型 復(fù)蘇 HUVEC 細(xì)胞株，以 10% FBS 的培 養(yǎng)基，在 37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞消化 傳代后，接種 6 孔板，37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中過(guò)夜， 第 2 天吸去培養(yǎng)基，PBS 洗兩遍，每孔加入 1． 5 mL 10 μg·L － 1 TGF-β1 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。

Fli1 siＲNA 序列及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 設(shè)計(jì) Fli1siＲNA 序列，吉瑪基因進(jìn)行合成 Fli1 siＲNA-1、 Fli1 siＲNA-2，然后分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h 后收集樣本進(jìn)行 QPCＲ 實(shí)驗(yàn)。

藥物制備: 補(bǔ)腎益 精法方藥購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，阿膠 10 g，山萸肉 10 g，熟地黃 20 g，黃芪 30 g，懷山藥 30 g，茯苓 15 g，川紅花 5 g，加蒸餾水 1 200 mL。浸 泡 20 min 后，沸煮45 min，過(guò)濾收集藥液。100 ℃水 浴蒸發(fā)使藥液濃縮至 134 mL ( 相當(dāng)于含生藥量 0． 9 g·mL － 1 ) 。 含藥血清的制備: 給藥組藥量按照 SD 大鼠實(shí) 際體質(zhì)量計(jì)算，每 100 g 體質(zhì)量給予生藥量 1． 8 g 的 補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方; 對(duì)照血清組按等體積灌胃生理 鹽水溶液。每天給藥 2 次，連續(xù) 3 d。末次給藥 3 h 后，嚴(yán)格無(wú)菌條件下由心臟 內(nèi)采血，以 2 500 r·min － 1 離心 15 min，離心半徑 12 cm，分離血清， 保存于 － 80 ℃冰箱備用。

對(duì)照血清組: 細(xì)胞培養(yǎng)基 中加入 10% 對(duì)照血清; 內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型組: 細(xì)胞 培養(yǎng)基中加入 10 μg·L － 1 TGF-β1 和 10% 對(duì)照血 清; 含藥血清組: 細(xì)胞培養(yǎng) 基 中 加 入 10 μg ·L － 1 TGF-β1 和 10% 含藥血清; 黃芪甲苷組: 細(xì)胞培養(yǎng)基 中加入 10 μg·L － 1 TGF-β1 和 30 μmol·L － 1 黃芪甲 苷; Fli1 siＲNA + 含藥血清組: 細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 10 μg·L － 1 TGF-β1 和10% 含藥血清和200 μmol·L － 1 Fli1 siＲNA。均處理 48 h。

HUVEC 細(xì)胞內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò) 程 10 μg·L － 1 TGF-β1 誘導(dǎo) HUVEC 細(xì)胞 48 h 后， 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

各 組 Fli1、VE-cadherin、 FSP1 的表達(dá)情況 6 孔板細(xì)胞 PBS 沖洗后加入 1 mL Trizol，吹打后收集到 EP 管內(nèi); 離心 15 min，取上 清。組織處理: 取組織于預(yù)冷的研缽中，加入液氮研 磨至粉末狀，收集到 EP 管內(nèi)加入 1 mL Trizol，反復(fù) 吹打; 離心 15 min，12 000 × g，取上清。向上清液中 加入 200 μL 氯仿，混勻靜置 3 min。12 000 × g 離心 15 min 后取上清 500 μL 到新的 EP 管內(nèi); 加入等體 積的異丙醇，混勻靜置 10 min 后，4 ℃ 12 000 × g 離 心 10 min 后去上清液，加入 1 mL 75% 乙醇，上下顛 倒，使沉淀塊重懸起。4 ℃ 12 000 × g 離心 10 min 后去掉上清液。晾干至管壁無(wú)液體。加入適量的 DEPC 水溶解 ＲNA，58 ℃水浴后取出 2 μL 定量，測(cè) 量 buffer: 10 mmol·L － 1 TrisCl( pH 7． 8) ，根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

采用 SPSS 24． 0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，組間比較采用 t 檢驗(yàn)。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。

TGFβ1 誘導(dǎo) HUVEC 細(xì)胞 48 h 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形 態(tài)變化，可見(jiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈多角形或梭形，提示內(nèi) 皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖 1。

2． 2 各組細(xì)胞

Fli1、VE-cadherin、FSP1 mＲNA 表 達(dá)比較 TGF-β1 誘導(dǎo) HUVEC 細(xì)胞后，QPCＲ 法檢 測(cè) Fli1、VE-cadherin、FSP1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組內(nèi)皮 標(biāo)志物 VE-cadherin 表達(dá)降低( P ＜ 0． 01) ，間質(zhì)標(biāo)志 FSP1 表達(dá)升高( P ＜ 0． 01) ，提示 TGF-β1 誘導(dǎo)內(nèi)皮 間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型建模成功; 同時(shí)模型組 Fli1 表達(dá)低于 對(duì)照組( P ＜ 0． 05) 。見(jiàn)表 1。

3 討論

SSc 發(fā)病機(jī)制主要?dú)w結(jié)于免疫異常、纖維化與 血管異常三大方面。SSc 常伴不同程度血管損害的 表現(xiàn)，如雷諾現(xiàn)象、指尖潰瘍等，且雷諾現(xiàn)象常為本 病首發(fā)現(xiàn)象，提示血管損害常出現(xiàn)在早期，是本病發(fā) 病的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。研究顯示，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與硬皮病的發(fā)生發(fā)展。SSc 血管周圍微環(huán)境可引起血 管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，肌成纖維細(xì)胞數(shù) 量增加，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué) 特性顯著變化，細(xì)胞獲得強(qiáng)大的增殖、遷移和收縮能 力。此過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞失去 VE-cadherin 等特異 性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，同時(shí)獲得如 FSP1 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo) 志物。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與多條通路的介導(dǎo)有關(guān)，其 中最重要的是 TGF-β 通路。TGF-β1 是早期啟動(dòng) SSc 組織纖維化的重要因子，可促進(jìn)多種細(xì)胞外基 質(zhì)的表達(dá)。因此，對(duì) TGF-β1 通路的干預(yù)已經(jīng)成為 硬皮病治療的重要靶點(diǎn)。