1 材料與方法 

1． 1 藥品和儀器 

酪酸梭菌雙岐桿菌二聯活菌購 于山東科興生物制品公司; 米非司酮由深圳市資福 藥業有限公司提供; Hamster Anti-mouse CD3e FITC、 Ｒat Anti-Mouse CD4 PE-CYTM5、Ｒat Anti-Mouse CD8a PE-CYTM7 ( 美 國 BD Pharminge 公 司) ; Anti-Mouse CD279 PE、Anti-Mouse CD28 PE( 美國 e Bioscience 公司) ; 小鼠紅細胞裂解液( Biosharp 公司) ; 高速低 溫離心機、各種規格移液器( 美國 Thermo Fisher 公 司) ; Beckman Coulter FC500 流 式 細 胞 儀 ( 美 國 Beckman Coulter 公司) ; 臺式低速離心機( 湘儀離心 機器械廠) ; XW-80A 旋渦混合儀( 海門市其林貝爾儀器制造公司) 。 

1． 2 動物 

8 周齡 SPF 級 BALB /c 健康成年小鼠 ( 雌性 18 只，雄性 9 只) ，體質量 18 ～ 22 g( 江蘇省 南京市青龍山動物飼養中心提供) ，雌雄小鼠采用 2 ∶ 1 配對飼養。 

1． 3 早產及足月小鼠造模 

用米非司酮( ＲU486) 腹腔注射無菌孕鼠建立早產模型。雌鼠檢查到 陰栓記為妊娠第 1 天，單籠飼養，隨機選擇部分孕鼠 于孕第 18 天及第 19 天晨 8 點腹腔注射用蓖麻油溶 解的米非司酮( 劑量 0． 15 mg /kg，) ，獲得胎齡 ＜ 20 d 的新生早產小鼠。另外的孕鼠待其自然分娩，收 集胎齡 ＞ 20 d 的新生足月小鼠。 

1． 4 分組及給藥 

隨機將 P1 早產小鼠分為早產實 驗組( Ⅰ組) 和早產對照組( Ⅱ組) ，同日齡足月小鼠 為足月對照組( Ⅲ組) ，每組 16 只。Ⅰ組給予酪酸 梭菌雙岐桿菌二聯活菌灌胃 ( 灌胃體積為 100μL /10g) ，同一時間，給予Ⅱ組與Ⅲ組等量生理鹽水 灌胃，均于灌胃后按窩返回母鼠身邊飼養。 

1． 5 取血 

各組分別在 P14、P21 隨機選取小鼠 8 只，乙醚麻醉，眼球取血法取血 ＞ 500 μL，EDTA-K2 抗凝后，置于冰上備用。 

1． 6 CD28 和 PD1 分子檢測 

取 2 只流式管分別 標為①、②，向兩管中各加入 100 μL stain buffer、熒 光標記的抗體 CD3e-FITC、CD4-PEcy5、CD8-PEcy7 各 1 μL; 再向①管中加入 1 μL CD279-PE，②管加入 1 μL CD28-PE; 兩管中各加入外周血 100 μL，避光 孵育 20 min; 兩管分別加入鼠紅細胞裂解液 2 mL， 裂解 2 min，1500 rpm 離心 5 min，重復 1 次; 兩管加 stain buffer 各 2 mL，1500 rpm 離心 5 min，倒去上清 液，重復 1 次; 兩管加 stain buffer 各 700 μL 后上機 檢測; 采用 Flow Jo VX 軟件進行 CD28、PD1 的表達 量分析。 

1． 7 統計方法 

采用 GraphPad Prism 6． 0 軟件進 行統計分析，用 Holm-Sidak 檢驗進行多組間兩兩比 較，兩組間、組內比較用獨立樣本 t 檢驗。P ＜ 0． 05 為差異有統計學意義。

2 結果 

2． 1 早產對小鼠 CD4 + T 細胞表面 CD28 表達水平 的影響 

為新生小鼠 CD4 + T 細胞 表面 CD28 表達圖。在 P14，Ⅱ組小鼠 CD4 + T 細胞 表面 CD28 的表達與Ⅲ組比較差異無統計學意義( P = 0． 073) ; 而在 P21，Ⅱ組 CD28 的表達量高于Ⅲ組 ( P = 0． 040) 。并且Ⅱ組 CD28 的表達量隨 日齡的增加而升高( P = 0． 024) ; 而Ⅲ組 CD28 的表 達隨著時間的延長未見明顯變化( P = 0． 108) 。 

2． 2 早產對小鼠 CD4 + T 細胞表面 PD1 表達水平的影響 

新生小鼠 CD4 + T 細胞 表面 PD1 表達圖。在 P14，Ⅱ組小鼠 CD4 + T 細胞表面 PD1 的表 達 與Ⅲ組比較差異無統計學意義( P = 0． 225) ; 而在 P21，早產對照組 PD1 的表達量高于Ⅲ 組( P =0． 000) 。并且Ⅱ組 PD1 的表達量隨 日齡的增加升高( P = 0． 000) ; 而Ⅲ組 PD1 的表達隨 著時間的延長未見明顯變化( P =0． 393) 。

2． 3 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯活菌對早產小鼠 CD4 + T 細胞表面 CD28 表達的影響 

在 P14 和 P21，Ⅰ組 CD4 + T 細胞表面 CD28 的表達均 高于Ⅱ組( t = 6． 784，t = 4． 577，P 均 = 0． 000) 和Ⅲ 組( t = 4． 315，t = 6． 746，P 均 = 0． 000) 。 而Ⅰ組 CD28 的表達在 P14 與 P21 未見明顯差異( t= 1． 567，P = 0． 139) 。

3 討論 

酪酸梭菌雙岐桿菌二聯活菌是酪酸梭狀芽孢桿嬰兒型雙歧桿菌混合制劑，可以促進腸道有益 菌的生長，維持腸道菌群的平衡，對腸道內病原菌的 抑制有顯著作用。Ling 等發現酪酸梭菌雙歧 桿菌混合物可能是治療抗生素相關性腹瀉( AAD) 的一種簡單有效的方法。有臨床研究表明，肺炎 住院兒童在應用抗生素的基礎上加用酪酸梭菌雙岐 桿菌二聯活菌，可有效降低其發生 AAD 的風險，未發現其不良反應。

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